第四节 其它实验性操作技术
一、细胞培养技术
活细胞离体后要在一定的生理条件下才能存活和进行生理活动,否则就要死亡。因此,要进行体外细胞培养,就要尽可能满足细胞在正常体内生理状态下的各种条件,其中选择最佳培养基是最关键的因素。细胞培养(cell culture)技术或称组织培养(tissue culture)技术即是选用各种最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。细胞培养技术又可分为动物细胞培养、植物细胞培养和微生物培养(发酵)技术。在此,主要向大家介绍一下动物细胞培养和植物细胞培养。
1.动物细胞培养
组织培养工作开始于20世纪初,Harrison(1907)最早对两栖类胚胎的神经管组织进行了悬滴培养。真正开创大规模细胞培养工作是在20世纪40年代,W.Earle和R.Dulbecco设计出了细胞培养液配方,并开始了单细胞的悬液培养,细胞培养工作才得到广泛发展。
动物细胞培养方式大致可分为两种:
群体培养:将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中,让细胞贴壁生长,汇合后形成均匀的单细胞层;
克隆培养:将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中,经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落,此种集落即称为克隆(clone)。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。
此外,为了制取细胞产品而设计了规模培养法,如转鼓培养法、发酵罐培养。
针对不同种类的细胞,学者们设计出了许多细胞培养基配方,目前使用比较广泛的化学合成培养基(chemically defined medium)有TC-199、MEM、DMEM、F12、L-15和RPMI-1640等。但是在工作中要针对不同的培养对象来选择最适培养基,培养基选择恰当与否是细胞培养是否成功的关键。
在细胞培养工作中,有几种因素需要特别关注:
①细胞所需要的营养成分要尽量予以满足;
②要保持适当的渗透压;
③严格控制pH;
④添加细胞所需的生长因子。
为了满足细胞生长所需的一些营养条件,常在培养液中加入适量的血清。然而血清的来源有限,而且血清的成份复杂,影响实验结果的分析,因而近来研究出无血清培养技术。
通过细胞培养,世界上已建立了大量细胞株或细胞系。
正常组织的初级培养物,细胞传代培养均有一定的限度,只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。所谓转化(transformation)即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。如HeLa细胞系(1951年从Henrietta Lacks的宫颈癌细胞培养而成)。迄今我国业已建立了上百个细胞系,为细胞生物学和医学做出了重大贡献。
动物细胞培养在细胞生物学中是一项极为重要的实验技术,也是生物工程中不可缺少的重要手段。
细胞生物学中有大量的生理、生化方面的研究成果,都是通过细胞培养、再结合其他技术取得的。现已渗透到生命科学的各个研究领域,如生物化学、遗传学、生理学、免疫学、分子生物学和发育生物学等等。
2. 植物细胞培养
植物细胞培养最明显的特点是:
①可进行组织培养,由外植体生长出植株;
②不易无限传代和建立细胞株。
植物细胞培养大体有如下几种技术:
(1) 外植体培养,诱发产生愈伤组织:如果条件适宜,尚可培养出再生植株。
(2) 悬浮细胞培养:在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。
(3) 原生质体培养:细胞杂交,转基因等
(4) 单倍体培养:通过花药或花粉培养获得单倍体植株。
二、显微操作术
为了直接对微小细胞进行手术操作和解剖,又设计发明了显微操作技术。
所谓显微操作术(micromanipulation)就是在显微镜下,用显微操作装置对细胞进行解剖手术和微量注射的技术。
三、细胞融合
真核细胞通过介导和培养,两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization)。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体(homokaryon);来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体(heterokaryon)。
目前诱导细胞融合的方法主要有三种:
1. 病毒介导的细胞融合(如仙台病毒)
2. 化学介导的细胞融合(如PEG)
3. 电激介导的细胞融合
细胞融合不仅可用于基础研究,而且还有重要的应用价值,如动植物育种和制备单克隆抗体等。
四、染色体分析技术
(一) 染色体标本制做与核型分析:
1. 染色体标本制做:
美籍华人学者徐道觉(T.C. Hsu)首先创用低渗法。华裔学者庄有兴(Joe Hin Tjio)和瑞典学者A. Levan合作,利用低渗法研究胎儿肺组织,终于在1956年首次确定了人类染色体数是46条,而不是前人所主张的48条。
染色体标本制作的四大要点:
1. 植物血球凝集素(phytohemagglutinin, PHA)可使淋巴细胞返幼,恢复分裂能力;(适于外周血培养)
2. 秋水仙素通过破坏纺锤丝使中期染色体不发生分离;
3. 低渗处理使细胞膨胀,使染色体分散开来;
4. 空气干燥法使染色体平铺到载片上。
2. 核型:
真核生物中染色体的数量和形态具有物种的特异性,将体细胞核中的全部染色体的显微图象按照大小、着丝粒位置,以至带型有序地排列起来,此图象排列即称为核型或染色体组型。
核型分析均以中期染色体为准,迄今一直可依此作为物种分类的基本依据之一。
3. 染色体分带
染色体分带技术(徐道觉, 1969)利用一定的染色方法可显示出染色体上有一定排列顺序的明暗相间的带,带的排列方式称为带型(binding pattern)。 每一染色体均各具有特定的带型!分带技术为鉴别人类染色体提供了一种新方法,可根据带型将每条染色体一一区别开来。