第一节 形态观察技术
形态观察包括:光学显微镜(普通光镜和特殊光镜)和电子显微镜(透射式电子显微镜、扫描式电子显微镜、扫描隧道电子显微镜、冰冻蚀刻技术)
一、光学显微镜
特殊光镜包括:紫外光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、微分干涉差显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜。
1. 紫外光显微镜
以紫外线(波长介于400nm与X射线之间)为光源,分辨率可提高1倍,可以看到许多在普通光学显微镜下看不到的胶体颗粒。此外,核酸和有些蛋白质可吸收一定波长的紫外线,因而这种显微镜可用来测定细胞核中的核酸含量。然而,波长越短的紫外线越不易穿透普通玻璃,故必须用以特殊材料(如石英、萤石(CaF2)、碳酸锂等)制造的光学玻璃来制作显微镜透镜,造价较高。另外,紫外线显微镜还要求配置有照相装置,价格比较昂贵。
2. 暗视野显微镜
这种显微镜使照明光线不能直接进入物镜,只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜。
3 . 相差显微镜
荷兰物理学家F. Zernike(1932):提高了活细胞结构的反差,从而解决了对活细胞观察的难题。获诺贝尔物理奖(1953)
4. 微分干涉差显微镜
其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比,其标本可略厚一点,折射率差别更大。DIC显微镜首先DIC利用的是偏振光。此外,除了物镜外,还增加了四个光学组件:偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器(analyzer)。
DIC显微镜使细胞的细微结构立体感特别强,适合于显微操作。目前像基因注入、核移植等生物工程的显微操作常在这种显微镜下进行。
5. 荧光显微镜
荧光是指某些物质在一定波长光(如紫外光)的照射下、在极短时间内所发出的比照射光波长更长的可见光
6. 激光扫描共聚焦显微镜
LCSM是采用激光作为光源,在普通光镜上采用共轭聚焦原理和装置,并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。主要系统包括:激光光源、自动显微镜、扫描模块(共聚焦光路通道、针孔、扫描镜、检测器)、数字信号处理器、计算机、图象输出设备(显示器、彩色打印机) 。
LCSM显微镜可以对观察样品进行断层扫描和成像,故能无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构;同时,LCSM显微镜也是对活细胞进行动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。
特点:通过共聚焦可进行光学切片;
样品制作方便,对固相、液相物体均可进行观察,并可进行活体检测;
高效迅速的荧光信号获取,图片质量高,数据分析直观迅速;
多通道荧光同时检测,扫描迅速,样品淬灭慢.
LCSM META技术的应用,实现了荧光检测技术的重大突破,可以适应目前不断发展的新的荧光标记技术的应用(如各种荧光蛋白的应用),还可以方便高效地进行目前最先进的动态细胞分析技术,如FRAP、FRET等,为实验研究提供了更加灵活、多样的的手段和方法。
二、电子显微镜
分辨力(resolution)是指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用相邻两点间的距离来表示。
限制显微镜分辨率的关键因素是光的波长,一般光学显微镜的最大放大倍数为1000~1500。小于0.2mm的一些细微结构,称为亚显微结构(submicroscopic structure)或超微结构(ultrastructure),在光学显微镜下无法看清。要想看清这些结构,就必须选择波长更短的光源,以提高显微镜的分辨率。
电子束的波长要比可见光和紫外光短得多,电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比,也就是说电压越高波长越短。
Ruska(1933~1938)便选择了电子束为光源来突破光学显微镜分辨率的极限,发明了透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)。
电子显微镜与光镜的主要区别
| 电镜 | 光镜 |
电源 | 电子束 | 可见光 |
透镜 | 电磁透镜 | 玻璃透镜 |
聚焦方式 | 电磁聚焦 | 机械聚焦 |
切片厚度 | 超薄切片0.05µm | 石蜡切片1-10µm |
图像 | 黑白 | 彩色 |
1. 透射电子显微镜
可见光波长为400~700nm,显微镜分辨率的最小数值不会小于0.2mm,这一数值是光学显微镜分辨率的极限。
透射电子显微镜以短波长电子束为光源,利用电磁透镜成像。分辨力0.1~0.2nm,放大倍数可达百万倍;用于观察超微结构(ultrastructure),即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构,又称亚显微结构(submicroscopic structures)。
由于样品不同部位的质量厚度不同,高速电子透过样品的数量也不同,透射电子打到荧光屏上所显示出的亮度便各不相同,因此就会产生一个明暗不同的像。图像各处浓淡的不同真实反映了样品不同部位的物质结构。
投射电镜的结构分:真空系统
供电及保护系统
电子照明系统
成象系统
观察记录系统
由于电子束不能透过玻璃,因此用于电镜的标本须制成厚度仅有0.05mm的超薄切片,并放在铜网上。这种切片需要用超薄切片机制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍。
2. 扫描电子显微镜
用来观察标本的表面形态结构。经扫描线圈控制电子束在样品表面进行扫描,而标本表面上发射出的次级电子,被带阳电荷的栅极收集后,从而向电子显象管发送信号,在荧光屏上显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象,反映了标本表面的真实结构。
3. 扫描隧道显微镜
Binnig、Rohrer等(1981)发明:荣获1986年诺贝尔奖!
据量子力学中隧道效应设计,用来显示晶体表面原子布阵。其关键部件是有一个加上一定电压的精密探针,当探针接近物质时,由于‘隧道效应’而有电子飞出,从而在探针与物质之间有电流通过。当探针沿物质表面扫描时,使探针与物质表面间的距离不断发生改变,从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图象化,即可显示出原子水平的凹凸形形态。
扫描隧道显微镜的分辨率很高(横向为0.1-0.2nm,纵向可达 0.001nm)。其优越之处:三态(固态、液态和气态)物质均可进行观察。扫描隧道显微镜能直接观察生物大分子(如DNA、RNA和蛋白质等)的原子布阵,也能观察一些生物结构(如生物膜、细胞壁等)的原子排列,把生物学研究推进到纳米科学水平。
4. 冰冻蚀刻技术
冰冻蚀刻技术亦称冰冻断裂(freeze-fracture),是研究生物膜内部结构的一种有用的技术,关于膜结构的许多资料即是利用这种方法取得的。冰冻断裂技术也是研究细胞内部各种细胞器结构的有用手段。