第二节
生物化学分析技术
一、组织化学和细胞化学技术
组织化学和细胞化学染色方法(histochemical and cytochemical staining method)依据化学反应原理，对无色透明细胞的某些成分进行定性和定位研究。
细胞化学染色是利用染色剂可同细胞某种成份发生反应而着色的原理，对该成份进行研究和分析的技术。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。
最典型的组织化学显示法是Feulgen反应显示法(Feulgen reaction)。此法由Feulgen和Rossenbeck (1924)发明，对DNA的反应具有高度专一性。其原理是: 标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红与醛基反应，形成含有醌基(发色团)的化合物，呈现出紫红色。
二、免疫细胞化学(immunocytochemistry)
免疫细胞化学是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原结合，对抗原进行专一定位测定的技术。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原在组织中的存在部位及其相对丰度。
抗体与抗原的结合方法可分为以下两种：
直接法：将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位。
间接法：在抗体-抗原初级反应的基础上，再用带标记之次级抗体与初级抗体反应，来放大初级反应，增强显示效果。
常用的标记物有荧光素、酶和放射性同位素：
标记荧光素的称为荧光免疫法(Fluoroimmunoassay, FIA)，常用的萤光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(rhodamine)等。
标记酶的称为酶标免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)，常用的酶有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)等。
标记同位素的称为放射免疫法(Radioimmunoassay, RIA )，常用的同位素有3H、14C、32S和31P等。
三、显微光谱分析技术
细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸(260nm)、蛋白质(280nm)、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。
有的成分经组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。
根据细胞成分所具有的这种特性，可利用细胞分光光度计(cytospectrophotometer)对一定的成分进行定位、定性，甚至定量测定。
四、放射自显影术
放射性同位素发射出的各种射线能使照相乳胶中的溴化银晶体还原(感光)。利用放射性物质使照相乳胶膜产生该物质自身影像的技术，称为放射自显影术。
放射自显影的切片用染料染色后，便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或定量测定。
由于有机大分子均含有碳、氢原子，故实验室一般常选用14C和3H标记(14C和3H均为弱β放射性同位素；半衰期长: 14C为5730年，3H为12.26年)。一般常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷来显示DNA，用3H-尿嘧啶核苷显示RNA。在研究蛋白质和粘多糖时，则分别选用3H-氨基酸和3H-甘露糖、3H-岩藻糖等。放射自显影技术与电镜技术结合，也可进行电镜自显影(electron-microscopic autoradiography)。
五、超离心技术
要研究细胞的各中结构和成分的化学性质和生理功能，需要把它们分离和抽提出来进行研究。
离心是研究亚细胞成分和生物大分子的必要手段。细胞匀浆后，悬液中含有各种细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体等）及各种大分子。要想把它们一一分离开，只利用普通低速离心机是很难做到的。
转速为10000~25000r/min（离心力小于89000g）的离心机称为高速离心机；转速超过25000r/min（离心力大于89000g）者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达80000r/min，离心力超过500000g。
被离心的物质所受的离心力不仅与转速有关，而且还同物质到转头中心的距离有关。因此要准确表示离心条件要用离心力，而不仅仅是转速。离心力(g)是由角速度和旋转半径(R)的大小决定的，单位为克，计算公式如下:
g = ω2·R g = (2πn)2 ×R
3600×980
各种颗粒在离心场中的沉降速度不同，这取决颗粒的大小、形状和密度，也与离心力以及悬液介质的密度和粘度有关。
当颗粒受到的净离心力（离心力与浮力之差）与溶剂的摩擦阻力达到平衡时，单位离心场强度的沉降速度为定值，此即为沉降系数(sedimentation coefficient, S)。
式中S为沉降系数(秒)；R为沉降颗粒到转头中心的距离(半径，cm)；ω为角速度，以每秒转动的弧度表示；t为时间(秒)。
根据分离的对象和目的不同，超离心技术可分为两大类：
制备离心(preparative cetrifugation)：用于制备和纯化亚细胞成分和大分子，目的是制备样品。
分析离心(analytical centrifugation)：分析和测定制剂中大分子的种类和性质(浮力密度和分子量等)。
流式细胞分选术(fluorescence-associated cell sorting, FACS)：流式细胞分选仪是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选。
流式细胞仪的基本结构主要由以下4部分组成：
(1) 流动室和液流系统：流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。
(2) 激光源和光学系统：常用的光源有弧光灯和激光；多种滤片(带阻或带通滤片); 二向色性分光器。
(3) 光电管和检测系统：光电倍增管；线性放大器，对数放大器。
(4) 计算机和分析系统：经放大后的电信号被送往计算机分析器。
除上述4个主要部分外，还备有电源及压缩气体等附加装置。
流式细胞仪具有三个特征：
(1)高速 (分析速度高达70,000～100,000个细胞/秒);
(2)同时分析单个细胞的多个参数;
(3)细胞分选 (可达7000个细胞/秒和99%的纯度)。
流式细胞仪主要用于单细胞群体的研究，多数细胞成分如蛋白质、RNA、DNA、膜质、离子(H+、Na+、K+和Ca2+)均可用荧光染料标记，因此，流式细胞仪可用于对这些成分的分析，还可用于细胞表面和细胞内的蛋白质活动及功能的研究，以及活细胞中荧光复合蛋白的研究。
应用举例：
细胞膜：流动性、膜电位、膜通透性;
细胞内离子浓度：H+、Na+、K+和Ca2+;
细胞周期：全周期分析、S期分析、M期分析;
细胞表面蛋白质分析：免疫细胞分型、其它表面蛋白分析;
细胞功能：如凋亡、抗药性;
基因表达：内源及外源基因表达;
细胞分选：分选速度可达7000个细胞/秒;
细胞克隆。
六、分子杂交技术
原理：具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。
在高pH值下，染色体DNA解链，带标记的核酸探针即可与染色体一定部位的互补单链DNA杂交。在不破坏细胞或细胞器的情况下，用核酸探针检测特定核苷酸序列在染色体上的精确位置的技术，称为原位杂交(in situ hybridization)。这种方法既可检测DNA序列，也可检测RNA序列。既可用放射性探针法，又可使用免疫探针法。
七、PCR技术
根据双链DNA的变性与复性和分子杂交原理设计出的技术，目的是将极微量DNA大量扩增。原理：将DNA片段经过若干次解链和复性循环，大量扩增，甚至可扩增到十几亿倍，以便于对已知DNA片段进行分析，如基因分析、序列分析、进化关系分析和临床诊断等。经过PCR获得的大量DNA片断都是以原有的微量DNA片断为模板扩增而来，故此技术亦称为分子克隆技术(molecular cloning)。
八、层析技术
用于细胞组分的分离及其纯化。
凝胶过滤柱层析
离子交换柱层析
亲合层析
