实验八  食品中亚硝酸盐含量的测定

一、目的与要求：

1、了解亚硝酸盐测定的原理和意义。

2、掌握亚硝酸盐测定的方法。

二、实验方法：

1、原理：

样品经沉淀蛋白质，除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸（HZN-C.6HSS03H）发生重氮化反应生成重氮盐，此重氮盐再与盐酸萘乙二胺发生偶合反应，生成紫红色偶氮化合物。其颜色深浅与亚硝酸含量成正比，故可比色测定。

2、试剂：

除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T6682 规定的二级水或去离子水。

①、亚铁氰化钾溶液(106g/L)：称取 106克亚铁氰化钾[K4Fe9(CN)5.3H2O]，溶于水后，稀释至 1000毫升。

②、乙酸锌溶液(220g/L)：称取220克乙酸锌[Zn(CH2COO)2·2H2O]，先加30mL冰醋酸溶解，用水稀释至1000 mL。

③、饱和硼砂溶液(50 g/L)：称取 5克硼酸钠(Na2B407·10H2O)，溶于 100毫升热水中，冷却后备用。

④、0.4％对氨基苯磺酸溶液：称取0.4克对氨基苯磺酸，溶于100毫升20％（V/V）的盐酸中，置棕色瓶中混匀，避光保存。

⑤、0.2％盐酸萘乙二胺溶液：称取0.2克盐酸萘乙二胺，溶于100毫升水中，置棕色瓶中，避光保存。

⑥、亚硝酸钠标准溶液（200 μg /mL）：准确称取0.1000ｇ于 110℃～120℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解移入 500 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

⑦、亚硝酸钠标准使用液（5.0 μg/mL）：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00 mL，置于200 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度。

3、实验仪器：

①天平：感量为0.1mg 和 1 mg。

②组织捣碎机/研钵

③超声波清洗器

④恒温干燥箱

⑤分光光度计

4、操作方法：

①、样品的预处理：

1）新鲜蔬菜、水果：将试样用去离子水洗净，晾干后，取可食部切碎混匀。将切碎的•样品用四分法取适量，用食物粉碎机制成匀浆备用。

2）肉类、蛋、水产及其制品：用四分法取适量或取全部，用食物粉碎机制成匀浆备用。

3）乳粉、豆奶粉、婴儿配方粉等固态乳制品(不包括干酪) ：将试样装入能够容纳2 倍试样体积的带盖容器中，通过反复摇晃和颠倒容器使样品充分混匀直到使试样均一化。

4）发酵乳、乳、炼乳及其他液体乳制品：通过搅拌或反复颠倒容器使试样充分混匀。

5）干酪：取适量样品研磨成均匀的泥浆状。为避免水分损失，研磨过程中应避免产生过多的热量。

②、提取及净化

称取混匀后的样品匀浆 40-50g（精确至0.01g），置于 50毫升烧杯中，加入硼砂饱和溶液12.5 毫升饱和溶液，搅拌均匀，以 70℃左右的水约150 毫升将样品全部洗入 250 毫升容量瓶中，置沸水浴中加热15 分钟，取出后冷至室温，然后一面转动一面加入 5 毫升亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5 毫升乙酸锌溶液以沉淀蛋白质，加水至刻度，混匀，放置 30 min，除去上层脂肪，清液用滤纸过滤弃去初滤液30 毫升，滤液备用。

③测定

1）亚硝酸盐标准曲线的制备：吸取0.00mL、0.01 mL、0.20mL、0.30 mL、0.40mL、0.50mL、0.75 mL、1.00mL、1.25mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0 μｇ、1.0μｇ、2.0 μｇ、3.0 μｇ、4.0 μｇ、5.0 μｇ、7.5 μｇ、10.0 μｇ、12.5 μｇ亚硝酸钠），分别置于25mL 带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入1mL 对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置 3 min～5 min，各加入0.5mL 盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用 1 cm 比色杯，以零管调节零点，于波长538nm 处测吸光度，绘制标准曲线。

2）样品测定：吸取20. 0ml 样品滤液于25 mL比色管中，加入1 毫升 0.4％对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3-5 分钟后加入 0.5毫升 0.2％盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15 分钟，用1 厘米比色杯，以零管调节零点，于波长 538nm 处测吸光度，从标准曲线上查出测定用样液中亚硝酸钠的含量（ug）。同时做试剂空白。

5、计算：

X =（m2×1000）/m1 ×(V2÷V1 )×1000

式中：

X1——样品中亚硝酸盐的含量，mg/kg;

m1一一样品质量，g;

m2——测定用样液中亚硝酸盐的质量，ug;

V1——样品处理液总体积，mL;

V2——测定用样液体积，mL 。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。

精密度：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 %。

6、说明与注意事项：

1）亚铁氰化钾和乙酸锌溶液作为蛋白质沉淀剂，使产生的亚铁氰化锌沉淀与蛋白质产生共沉淀。

2）蛋白质沉淀剂也可采用硫酸锌（30%溶液）。

3）饱和硼砂溶液作用有二：一是亚硝酸盐提取剂，二是蛋白质沉淀剂。

4）本试验用水应为重蒸水，以减少误差。

5）对氨基苯磺酸不易溶解时，可在具塞瓶中温水浴加热溶解。

6）显色时间应控制在 25min 左右，不可时间太长。