实验四  食品中蛋白质含量的测定

一、目的与要求：

1.掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及应用。

2.掌握微量凯式定氮法测定蛋白质的方法，包括样品的消化，蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。

二、实验方法：

1.原理：

凯氏定氮法：食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。其化学反应式如下。 

(1)2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4-----(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2

(2)(NH4)2SO4+2NaOH-----2NH3+2H2O+Na2SO4

(3)2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O

(4)(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O-(NH4)2SO4+4H2BO2

2、试剂：

除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682 规定的三级水。

①硫酸铜（CuSO4·5H2O）。

②硫酸钾（K2SO4）。

③硫酸（H2SO4密度为1.84g/L）。

④硼酸（H3BO3）。

⑤甲基红指示剂（C15H15N3O2）。

⑥溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5S）。

⑦亚甲基蓝指示剂（C16H18ClN3S·3H2O）。

⑧氢氧化钠（NaOH）。

⑨95%乙醇（C2H5OH）。

⑩硼酸溶液（20g/L）：称取 20 g 硼酸，加水溶解后并稀释至1000mL。

11.氢氧化钠溶液（400 g/L）：称取 40g 氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100mL。

12.硫酸标准滴定溶液（0.0500 mol/L）或盐酸标准滴定溶液（0.0500 mol/L或 0.01000mol/L）。

13.甲基红乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g 甲基红，溶于 95%乙醇，用95%乙醇稀释至 100mL。

14.亚甲基蓝乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g 亚甲基蓝，溶于 95%乙醇，用95%乙醇稀释至 100mL。

15.溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g 溴甲酚绿，溶于 95%乙醇，用95%乙醇稀释至 100mL。

16.混合指示液： 2 份甲基红乙醇溶液（13）与1 份亚甲基蓝乙醇溶液（14）临用时混合。也可用1份甲基红乙醇溶液（13）与5 份溴甲酚绿乙醇溶液（15）临用时混合。

3、实验仪器：

①天平：感量为1mg。

②凯氏微量定氮仪一套（消化炉+定氮蒸馏装置）。

③凯氏烧瓶（×4）100m1或 50ml 一只。

④容量瓶 100毫升 1 只。

⑤三角瓶 150ml（×3 组）

⑥吸量管 10ml×4只。5mL（×4）；

⑦酸式滴定管 5mL（×1）。

⑧吸耳球（×1）

4、操作方法：

①消化：精密称取充分混匀的固体试样0.2 g～2.0g、半固体试样2.0 g～5.0g 或液体试样10g～25g（约相当于30 mg～40mg 氮），精确至0.001g，移入干燥的 100ml 或500ml定氮瓶中，加入0.4g 硫酸铜，6g硫酸钾及 20mL 硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上，置于通风橱中电炉上加热。小火加热（不要使液体冲到瓶颈），待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将30％过氧化氢溶液 1 ~ 2 滴加到烧瓶底部消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成透明淡蓝绿色后，再继续加热0.5 小时。取下放冷，小心加入 20 mL 水。放冷后，移入100mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，定容备用取与处理样品相同量的硫酸、硫酸铜、硫酸钾按同一方法做试剂空白试验。

②

③滴定：

馏出液立即以 0.05mol/L盐酸标准滴定溶液滴定至终点，其中甲基红—亚甲基蓝指示剂，颜色由绿色变成浅粉色；甲基红—溴甲酚绿指示剂，颜色由紫红色变成灰色。记录盐酸的用量。

5、计算：

式中：

X——试样中蛋白质的含量，单位为克每百克（g/100 g）； 

V1——样品消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升（mL）；

V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升（mL）；

V3——吸取消化液的体积，单位为毫升（mL）；

c——硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；

0.0140——1.0mL 硫酸[c (1/2H2SO4)＝1.000mol/L]或盐酸[c (HCl) ＝1.000 mol/L]标准滴定•液相当的氮的质量，单位为克（g）；

m——试样的质量，单位为克（g）；

F——氮换算为蛋白质的系数。一般食物为 6.25；纯乳与纯乳制品为6.38；面粉为 5.70；玉米、高梁为 6.24；花生为 5.46；大米为 5.95；大豆及其粗加工制品为 5.71；大豆蛋白制品为 6.25；肉与肉制品为 6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为 5.30；复合配方食品为6.25。

6、精密度：

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，蛋白质含量≥1g/100 g时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量＜1 g/100 g 时，结果保留两位有效数字。

7、注意事项：

①样品应是均匀的，固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。

②样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。

③消化过程中应不时转动凯式烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下来并促进消化。在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下。使氮有损失。

④消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢 2-3ml，促使氧化。

⑤如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。

⑥加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。

⑦蒸馏前给水蒸汽发生器内装水至2/3 容积处，加数毫升稀硫酸及数滴甲基橙指示剂以使其始终保持酸性，水应呈橙红色，如变黄色时，要补加酸，这样可以避免在碱性时水中的游离氨被蒸出而影响测定结果。

⑧蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽，否则将发生倒吸。

⑨加碱要足量，操作要迅速；漏斗应采用水封措施，以免氨逸出损失。向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物[Cu(NH3)4]++